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今天想要筆記的是HPLC column的清洗方法,順便學一點有關HPLC的日文單字。
High Performance Liquid Chromatography, HPLC, 中文是高效液相層析法,日文是「高速液体クロマトグラフ」。做為分析實驗室裡面最重要的機器之一,穩定的漂亮的peak絕對是大家都想要的。其中column的狀態絕對是左右分析品質重要因素之一。
cover photo by National Cancer Institute on Unsplash
HPLC管柱為什麼要清洗?
HPLC裡面最靈魂的零件,column的狀況好不好直接左右分析的結果。如果不即時洗淨,還可能會縮短column的壽命。
カラム内に緩衡塩・イオン対試薬・酸などが残っていると加水分解を促進しますので、分析終了後は必ず洗浄してください。
出典 GL Science HPLCの上手な使い方ーⅠ章-4 カラムを長持ちさせるために1
緩衝液鹽類、離子對試劑、酸類等等物質如果殘留在管柱裡的話,會加速管柱填充物表面官能基的水解反應。所以分析完成後一定要把管柱內部洗乾淨。
- カラム column 管柱
- 緩衡塩 かんしょうえん 緩衝鹽類(緩衝溶液的鹽類)
- イオン対 いおんたい 離子對
- 加水分解 かすいぶんかい 水解反應
- 洗浄 せんじょう
簡單來說不洗乾淨會對column的分析效能有永久性傷害,輕則拖尾重則peak重疊。但是要怎麼洗呢?以下簡單教大家清洗column.
HPLC管柱的清洗方法
不同的管柱適用的清潔方法不同。但有個大原則:
其實分析時也是這樣。比如說高極性溶液突然換成低極性,鹼性突然換成酸性,這樣很容易讓雜質什麼的在管柱裡面析出或變性,讓column死更快。
常見的清洗方法(reverse phase ODS column為例)
以下引用出典:CERI LC Technical Report Vol.152
Step1.洗掉緩衝溶液的鹽類
まず緩衝液成分を除くために比率を変えずに有機溶媒/水を送液します。塩の析出や、カラム内に残っている不純物の析出及び変性を防止するためです。
首先用相同比例的溶劑/水沖提*,去除管柱裡殘留的緩衝液。這是為了防止殘在管著裡面的雜質析出(成固體)或變性。
- 有機溶媒 ゆうきようばい 有機溶劑
- 送液 そうえき
- 析出 せきしゅつ
- 変性 へんせい
一般HPLC的沖提液是有機溶劑/緩衝溶液的組合。如果像是某個方法是MeOH:pH3 buffer = 50:50,那麼第一步就是用MeOH:水 = 50:50清洗,約20分鐘。
如果直接用純buffer那就用UPW:MeOH=95:5沖。
*注意,如果有跑鹼性的化合物,例如胺類,buffer,或是鹼性離子對(ion pair)的方法,絕對不要直接換UPW,一定要用0.1%的磷酸或甲酸等弱酸性水溶液代替UPW。3
Step2.慢慢提高有機溶劑比例
ODSをはじめとする逆相系カラムでは、疎水性相互作用が強い成分がカラム内に残っている場合が多いため、有機溶媒比率を上げることで、洗浄効果が上がります。
(以逆相型管柱為例),如ODS(就是C-18)等逆相型管柱,疏水性的物質容易殘留在管柱裡,拉高有機溶劑的比例清洗效果也會提高。
- ODS OctaDecylSilyl,就是常聽到的C18管柱的主要修飾官能基
- 逆相系 ぎゃくそうけい
文章沒有說要用怎麼樣的變化速度,但是經驗上用每5-10分鐘10%的比例慢慢往上加應該就很夠了。
Step3.用100%的甲醇清洗20分鐘。
これで洗浄効果がみられない場合は、更に溶出力の強い溶媒を送液します。一般に使用される溶媒では溶出力が弱い順に、「メタノール<アセトニトリル<THF」となります。
(如果用100%的甲醇沖了20分鐘)也沒什麼效果,可以改用(對有機物)溶解力更好的溶劑。常見的溶劑的溶出力由低到高「甲醇<乙腈<THF四氫呋喃」。
- 溶出力 ようしゅつりょく
- メタノール methanol 甲醇
- アセトニトリル acetonitrile 乙腈(ㄐㄧㄥ)
- THF Tetrahydrofuran 四氫呋喃(ㄈㄨ ㄋㄢˊ)
可以試試「逆向清洗」
疎水性物質などの不純物は、カラム入口付近に蓄積するため、分析時とは逆に送液した方が、カラムから排出しやすい場合があります。洗浄操作は一般的な洗浄方法と同じですが、不純物が溶解しやすい有機溶媒を選択してください
疏水性物質(低極性)的雜質會在管柱的入口處堆積,所以如果和分析時的方向相反著沖提的話,雜質也許會比較容易排出來。逆向清洗的操作方式和一般清洗的方式一樣,建議選擇容易溶解雜質的有機溶劑。
- 疎水性物質 そすいせいぶっしつ
一般column都會有方向性,逆洗的時候建議流速開小一點,約分析時的一半即可。
用溶劑洗完之後…
如果要暫時不用要將column收起來…
可以讓溶劑保留在column裡,直接用盲塞塞起來就可以了。
或者是把column裡的溶液置換成出廠時內部裝的相同比例的溶液也可以。
不要放100%的水溶液(沒有有機溶劑)或讓column內部乾掉。
如果要接著繼續使用
將上述的說明的步驟倒過來執行,step.2→ step1就可以了。
也就是:
純溶劑→慢慢置換成「UPW(不含鹽類)+溶劑」到目標比例→再換成實驗用的沖提液4
清洗HPLC管柱時的注意事項
各段階における送液量は、カラム容積の約10倍程度 を目安とします。ただし緩衝液やイオンペア試薬の濃度、カラムに蓄積している物質によって、さらに送液が必要な場合もあります
每個清洗階段的溶液量,大概是column容積的10倍量就夠了。但是有用到緩衝溶液或離子對試劑,或是column裡面堆積了太多雜質的話,可能需要更多。
検出器や配管の汚染が懸念される場合は、カラム出口側の配管を必ず外してください
有污染偵測器或是儀器管路的風險時,一定要把管柱出口側的管子(從儀器上)移開。
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